LAPORAN MENGUKUR KUALITAS AIR DENGAN MPN (MOST PROBABLE NUMBER)

Tujuan : Untuk Mengetahui Kualitas Air



Landasan Teori

Air merupakan komponen esensial bagi kehidupan jasad hidup. Akan tetapi dapat juga merupakan suatu substansia yang membawa malapetaka, karena air dapat membawa mikroorganisme patogen dan zat-zat kimia yang bersifat racun (Tarigan, 1988). Bakteri coliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai bakteri berbentuk batang, gram negatif, tidak membentuk spora, aerobik, dan anaerobik fakultatif yang memfermentasi laktose dengan menghasilkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35° C (Pelczar.et al.,1988). Istilah “mikroorganisme indikator” sebagaimana digunakan dalam analisis air mengacu pada sejenis mikroorganisme yang kehadirannya di dalam air merupakan bukti bahwa air tersebut terpolusi oleh bahan tinja dari manusia atau hewan berdarah panas, artinya terdapat peluang bagi berbagai macam organisme patogenik,yang secara berkala terdapat dalam saluran pencernaan, untuk masuk ke dalam usus. Beberapa ciri penting suatu organisme indikator ialah :

1) Terdapat dalam air tercemar dan tidak ada dalam air yang tidak tercemar.

2) Terdalam dalam air bila ada bakteri pathogen.

3) Jumlah mikroorganisme indikator berkorelasi dengan kadar polusi.

4) Mempunyai kemampuan bertahan hidup yang lebih besar daripada bakteri patogen.

5) Mempunyai sifat yang seragam dan mantap.

6) Tidak berbahaya bagi manusia dan hewan.

7) Terdapat dalam jumlah yang lebih banyak daripada bakteri patogen.

8) Mudah dideteksi dengan teknik-teknik laboratorium yang sederhana.

Diantara organisme-organisme yang dipelajari, yang hampir memenuhi semua persyaratan suatu organisme indikator yang ideal ialah Escherichia coli dan kelompok bakteri coli lainnya. Bakteri-bakteri tersebut dianggap sebagai indikator polusi tinja yang dapat diandalkan (Pelczar.et al.,1988).

Sejumlah bakteri dianggap sebagai bakteri pengganggu dalam air karena menimbulkan bau, warna, dan rasa, di samping juga membentuk endapan persenyawaan tak dapat larut di dalam pipa-pipa sehingga mengurangi atau menyumbat aliran air. Aksi merusak pada beberapa mikroorganisme adalah sebagai berikut :
• Bakteri pembuat lendir : menghasilkan keadaan berlendir
• Bakteri besi : mengubah persenyawaan besi yang dapat larut menjadi bentuk yang tak dapat larut yang akan menghambat aliran air dalam pipa.
• Bakteri sulfur : Membentuk asam sulfat dengan hidrogen sulfide, yang dapat membuat air menjadi sangat asam dan berbau tidak enak.
• Algae : Menyebabkan kekruhan,perubahan warna, serta bau dan rasa tidak enak (Pelczar.et al.,1988).
Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test), uji penetapan (confirmed test), dan uji kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan coliform masih dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat fermentatif coliform dalam sampel. Karena beberapa jenis bakteri selain coliform juga memiliki sifat fermentatif, diperlukan uji konfirmasi untuk mengetes kembali kebenaran adanya coliform dengan bantuan medium selektif diferensial. Uji kelengkapan kembali meyakinkan hasil tes uji konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif dan pengamatan mikroskop terhadap ciri-ciri coliform: berbentuk batang, Gram negatif, tidak-berspora (Fardiaz,1989).
Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk-koloni (colony-forming unit) dalam sampel. Namun, pada umumnya, nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram. Jadi misalnya terdapat nilai MPN 10/g dalam sebuah sampel air, artinya dalam sampel air tersebut diperkirakan setidaknya mengandung 10 coliform pada setiap gramnya. Makin kecil nilai MPN, maka air tersebut makin tinggi kualitasnya, dan makin layak minum. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi (FDA, 1989).


Bakteri Coliform
Bakteri coliform adalah bakteri indikator keberadaan bakteri patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya, bakteri coliform fekal adalah bakteri indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan coliform fekal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Selain itu, mendeteksi Coliform jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada mendeteksi bakteri patogenik lain. Contoh bakteri coliform adalah, Esherichia coli dan Entereobacter aerogenes. Jadi, coliform adalah indikator kualitas air. Makin sedikit kandungan coliform, artinya, kualitas air semakin baik (Friedheim, 2001).
Banyaknya kontaminan dalam air memerlukan standar tertentu untuk menjamin kebersihannya. Air yang terkontaminasi oleh bakteri patogen saluran cerna sangat berbahaya untuk diminum. Hal ini dapat dipastikan dengan penemuan organisme yang ada dalam tinja manusia atau hewan dan yang tidak pernah terdapat bebas di alam. Ada beberapa organisme yang termasuk kategori ini, yaitu bakteri coliform (E. coli), Enterococcus faecalis, Clostridium sp. Di Indonesia, bakteri indikator air terkontaminasi adalah E. coli (Gause, G. F. 1946).
Terdapatnya bakteri coliform dalam air minum dapat menjadi indikasi kemungkinan besar adanya organisme patogen lainnya. Keberadaan E. coli dalam air dapat menjadi indikator adanya pencemaran air oleh tinja. E. coli digunakan sebagai indikator pemeriksaan kualitas bakteriologis secara universal dalam analisis dengan alasan; a) E. coli secara normal hanya ditemukan di saluran pencernaan manusia (sebagai flora normal) atau hewan mamalia, atau bahan yang telah terkontaminasi dengan tinja manusia atau hewan; jarang sekali ditemukan dalam air dengan kualitas kebersihan yang tinggi, b) E. coli mudah diperiksa di laboratorium dan sensitivitasnya tinggi jika pemeriksaan dilakukan dengan benar, c) Bila dalam air tersebut ditemukan E. coli, maka air tersebut dianggap berbahaya bagi penggunaan domestik, d) Ada kemungkinan bakteri enterik patogen yang lain dapat ditemukan bersama-sama dengan E. coli dalam air tersebut (Gause, G. F. 1946).
Bakteri pembusuk ini dimasukkan ke dalam golongan bakteri Coliform, salah satu yang termasuk didalamnya adalah Escherichia coli. Bakteri coliform ini menghasilkan zat ethionine yang pada penelitian menyebabkan kanker. Bakteri-bakteri pembusuk ini juga memproduksi bermacam-macam racun seperti Indole, skatole yang dapat menimbulkan penyakit bila berlebih didalam tubuh (Gause, G. F. 1946).
Bakteri coliform merupakan parameter mikrobiologis terpenting kualitas air minum. Kelompok bakteri coliform terdiri atas Eschericia coli, Enterobacter aerogenes, Citrobacter fruendii, dan bakteri lainnya. Meskipun jenis bakteri ini tidak menimbulkan penyakit tertentu secara langsung, keberadaannya di dalam air minum menunjukkan tingkat sanitasi rendah. Oleh karena itu, air minum harus bebas dari semua jenis coliform. Semakin tinggi tingkat kontaminasi bakteri coliform, semakin tinggi pula risiko kehadiran bakteri-bakteri patogen lain yang biasa hidup dalam kotoran manusia dan hewan. Salah satu contoh bakteri pathogen yang kemungkinan terdapat dalam air terkontaminasi kotoran manusia atau hewan berdarah panas-adalah Shigella, yaitu mikroba penyebab gejala diare, deman, kram perut, dan muntah-muntah (Official Chemical Method, 1979).
Jenis bakteri coliform tertentu, misalnya E coli O:157:H7, bersifat patogen dan juga dapat menyebabkan diare atau diare berdarah, kram perut, mual, dan rasa tidak enak badan (Dad,2000). Tahapan dalam uji kualitas air menggunakan MPN:
Uji Penduga (Presumptive test)
Merupakan tes pendahuluan tentang ada tidaknya kehadiran bakteri coliform berdasarkan terbentuknya asam dan gas yang disebabkan oleh fermentasi laktosa oleh bakteri golongan coli. Terbentuknya asam dilihat dari kekeruhan pada media laktosa, dan gas yang dihasilkan dapat dilihat dalam tabung Durham berupa gelembung udara. Tabung dinyatakan positif jika terbentuk gas sebanyak 10% atau lebih dari volume di dalam tabung Durham. Banyaknya kandungan bakteri coliform dapat dilihat dengan menghitung tabung yang menunjukkan reaksi positif terbentuk asam dan gas dan dibandingkan dengan tabel MPN.
Tabel MPN-Seri 9 Tabung
Jumlah Tabung Positif MPN
Seri A Seri B Seri C
2 0 2 0,20
2 0 3 0,26
2 1 0 0,15
2 1 1 0,20
2 1 2 0,27
2 1 3 0,34
2 2 0 0,21
2 2 1 0,28
2 2 2 0,35
2 2 3 0,42
2 3 0 0,29
2 3 1 0,36
2 3 2 0,44
2 3 3 0,53
3 0 0 0,23
3 0 1 0,39
3 0 2 0,64
3 0 3 0,95
3 1 0 0,43
3 1 1 0,75
3 1 2 1,20
3 1 3 1,60
3 2 0 0,93
3 2 1 1,50
3 2 2 2,10
3 2 3 2,90
3 3 0 2,40
3 3 1 4,60
3 3 2 11,00
3 3 3 >24,00


Uji Penetapan (Confirmed Test)
Hasil uji dugaan dilanjutkan dengan uji ketetapan. Dari tabung yang positif terbentuk asam dan gas terutama pada masa inkubasi 1 x 24 jam, suspensi ditanamkan pada media Eosin Methylen Biru Agar (EMBA) secara aseptik dengan menggunakan jarum inokulasi. Koloni bakteri Escherichia coli tumbuh berwarna merah kehijauan dengan kilat metalik atau koloni berwarna merah muda dengan lendir untuk kelompok coliform lainnya.
Uji Pelengkap (Completed Test)
Pengujian selanjutnya dilanjutkan dengan uji kelengkapan untuk menentukan bakteri Escherichia coli. Untuk mengetahui bentuk pada bakteri yang akan diteliti perlu dilakukan pewarnaan bakteri (pewarnaan Gram). Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan seperti zat pewarna kristal violet, larutan iodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin. Pewarnaan dilakukan dengan menggunakan kristal violet karena kristal violet memiliki sifat alkalin yang mampu mengikat sitoplasma bakteri yang bersifat negatif. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.
Pewarnaan gram pada uji pelengkap
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara Pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
• Zat warna utama (Kristal Violet)
• Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.
• Pencuci / peluntur zat warna (alkohol / aseton) yaitu solven organik yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
• Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alkohol.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu
1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
• Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
• Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam
• lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.
• Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
• Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
• Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
• Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
• Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
• Peka terhadap streptomisin
• Toksin yang dibentuk Endotoksin
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
• Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
• Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
• Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
• Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
• Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
• Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
• Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
• Tidak peka terhadap streptomisin
• Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Menurut Supardi dan Sukamto (1999), bakteri coliform dapat dibedakan menjadi dua bagian, yaitu.
1) Coliform fekal, misalnya E. coli, merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan atau manusia.
2) Coliform non-fekal, misalnya E. aeroginosa, biasanya ditemukan pada hewan atau tanaman yang telah mati.
Beberapa macam mikroorganisme patogen yang mengkontaminasi air, antara lain:
a) Salmonella typhi, adalah bakteri gram negatif berbentuk batang, tidak membentuk spora namun bersifat patogen, baik pada manusia ataupun hewan. Dapat menyebabkan demam typhoid (typoid fever). Sebenarnya penyakit demam typoid dapat dipindahkan dengan perantara makanan yang terkontaminasi dan dengan kontak langsung dengan si penderita. Namun yang paling umum sebagai fakta penyebab adalah air. Air dapat terkontaminasi oleh bakteri ini karena kesalahan metode pemurnian air atau kontaminasi silang (Cros contaminant) antara pipa air dengan saluran air limbah (Tarigan, 1988).
b) Clostridium prefringens adalah bakteri gram positif pembentuk spora yang sering ditemukan dalam usus manusia, tetapi kadang-kadang juga ditemukan di luar usus manusia (tanah, debu, lingkungan dan sebagainya).
c) Escherichia coli adalah bakteri gram negatif berbentuk batang yang tidak membentuk spora dan merupakan flora normal di dalam usus. E.coli termasuk bakteri komensal yang umumnya bukan patogen penyebab penyakit namun bilamana jumlahnya melampaui normal maka dapat pula menyebabkan penyakit. E. Coli merupakan salah satu bakteri coliform.
d) Leptospira merupakan bakteri berbentuk spiral dan lentur yang merupakan penyebab penyakit leptosporosis. Penyakit ini merupakan penyakit zoonosis atau penyakit hewan yang bisa berpindah ke manusia. Pada umumnya penyebaran bakteri ini adalah pada saat banjir.
e) Shigella dysentriae adalah basil gram negatif, tidak bergerak. Bakteri ini menyebabkan penyakit disentri (mejan). Spesies lain seperti S. Sonnei dan S. Paradysentriae juga menyebabkan penyakit disentri (Dwijoseputro, 1976).
f) Vibrio comma adalah bakteri yang berbentuk agak melengkung, gram negatif dan monotrik. Bakteri ini menyebabkan penyakit kolera yang endemis di indonesia dan sewaktu-waktu berjangkit serta memakan banyak korban (Dwijoseputro, 1976)

Alat dan bahan
Alat

 Tabung reaksi (10 bh)
 Bunsen (1 bh)
 Tabung Durham (10 bh)
 Mikroskop (1 bh)
 Gelas beaker (2 bh)
 Objek glass (1 bh)
 Pipet tetes (5 bh)
 Cawan petri (1 bh)
 Autoklaf 1 bh
 Mikrofoto 1 bh
 Inkubator 1 bh
 Petridish 1 bh
 Rak tabung reaksi 1 bh
 Cover glass 1 bh
 Jarum Inokulasi/Ose 1 bh

Bahan

 Es batu di warung
 Iodium
 LB (Laktosa Broth)
 Safranin
 EMBA (Eosin Metilen Blue Agar)
 Aquades
 Kristal violet
 Alkohol 70 %
 Minyak Emersi
 Kapas
 Korek api


Prosedur Kerja
A. Uji Pendugaan (Presumtive test)
1. Menyiapkan 10 buah tabung reaksi , 3 diantara tabung reaksi tersebut berukuran lebih besar
2. Membagi 10 tabung tersebut menjadi 3 kelompok. Tiga tabung pertama diberi label C0,1. Tiga tabung ke dua diberi label C1. Dan 3 tabung ke 3 yang memiliki ukuran yang lebih besar diberi label C10. Dan satu tabung yang tersisa digunakan sebagai kontrol.
3. Memasukkan laktosa ke dalam tabung reaksi yang telah berisi label tadi masing-masing sebanyak 10 ml laktosa.
4. Mengisi tabung durham dengan laktosa yang sudah dimasukkan ke dalam tabung tadi hingga tabung durham penuh.
5. Memasukkan tabung durham ke dalam tabung reaksi yang telah terisi laktosa tadi, kemudian langsung ditutup dengan kapas. Apabila timbul gelembung saat tabung durham dimasukkan, ulangi lagi langkah seperti pada nomor 3 dan 4.
6. Mengambil 10 tabung tadi kemudian meneteskan satu tetes atau sekitar 0,1 ml es batu yang telah dicairkan ke dalam tabung yang diberi label C0,1 kemudian langsung ditutup kembali dengan kapas. Kemudian 1 ml atau 10 tetes es batu yang telah dicairkan ditetesi ke dalam tabung yang diberi label C1. Menetesi 10 ml es batu yang telah dicairkan ke dalam tabung yang diberi label C10 . Tabung control didiamkan tanpa diberi perlakuan.
7. Memasukkan ke sepuluh tabung ke dalam inkubator pada suhu 35˚C dan membiarkan selama 24 jam.

B. Uji Penetapan (Confirmed test)
1. Mengambil tabung reaksi yang terdapat gelembung dan keruh paling banyak dari inkubator yang telah diinkubasi selama 24-48 jam.
2. Menuangkan EMBA (Eosin Methylen Blue Agar) ke dalam cawan petri. Kemudian tunggu hingga setengah kering.
3. Mensuspensi tabung reaksi positif mengandung bakteri koliform dengan metode tuang ke dalam cawan petri. Kemudian ratakan dengan membentuk angka delapan.
4. Tunggu hinga kering dan balik cawan petri. Cawan petri kemudian dibungkus dengan kertas dan dimasukkan ke dalam inkubator selama 24 jam.

C. Uji Kelengkapan (Completed test)
1. Menyiapkan alat dan bahan yang telah disterilisasi untuk digunakan dalam pewarnaan gram.
2. Menyalakan bunsen, mensterilisasi jarum ose, kemudian menetesi objek glass dengan 1 tetes aquades.
3. Mengambil sampel bakteri pada permukaan medium secara hati-hati dengan menggoreskan jarum ose. Kemudian mensuspensikan bakteri yang telah diambil dengan menggunakan ose dan memfiksasinya.
4. Menetesi dengan 1 tetes kristal violet, diamkan selama 2 menit. Kemudian membilas dengan menggunakan aquades dan keringkan.
5. Menetesi kembali dengan 1 tetes iod, diamkan selama ½ menit. Kemudian membilas dengan menggunakan alkohol 70 % dan keringkan.
6. Menetesi dengan 1 tetes safranin, diamkan selama ½ menit. Kemudian bilas dengan menggunakan aquades dan keringkan.
7. Menetesi dengan menggunakan 1 tetes minyak emersi dan mengamati di bawah mikroskop .

8. Memperhatikan bentuk bakteri yang terlihat.

Hasil Pengamatan
A. Uji Pendugaan
Tabel 1. Hasil Uji Pendugaan
Presumtive test Tabung
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 K
Asam ++ ++ ++ + + + +++ +++* +++ -
Gas + + - + + + + +* + -
Jumlah tabung yang positif gas 2 3 3 0
Keterangan:
Tabung A = diisi es batu yang telah dicairkan sebanyak 0,1 ml
Tabung B = diisi es batu yang telah dicairkan sebanyak 1 ml
Tabung C = diisi es batu yang telah dicairkan sebanyak 10 ml
Tabung K = tidak diisi es batu yang telah dicairkan (kontrol)
Asam (+) = keruh Gas (+) = ada gelembung gas
Asam (-) = tidak keruh Gas (-) = tidak ada gelembung gas
+++* = warna paling keruh +* = gelembung paling besar

Pembahasan
Uji Pendugaan
Berdasarkan data hasil pengamatan dari percobaan yang dilakukan, kesemua tabung terdapat bakteri. Hal ini dapat dilihat dari adanya gelembung pada tabung durham yang mengindikasikan adanya pertumbuhan bakteri dalam tabung.
Dari data diatas dapat dilihat :
Pada tabung C 10 dari tiga tabung (C1, C2 daan C3) kesemua tabung terdapat gelembung yang ukurannya paling besar, tingkat kekeruhan paling tinggi. Dari ketiganya yang memiliki ukuran gelembung dan tingkat kekeruhan paling tinggi ada pada tabung C2.
Pada tabung C 1 kesemua tabung juga terdapat gelembung yang ukurannya sedang, tingkat kekeruhannya sedang diantara ketiga macam tabung
Pada tabung C 0,1 ada satu tabung yang tidak terdapat gelembung sedangkan dua tabung lain ada gelembung namun keadaan gelembungnya ukurannya paling kecil. Kesemua tabung pada C 0,1 kerung, namun tingkat kekeruhannya paling rendah.

Gas yang terlihat pada sebagian besar tabung durham merupakan hasil fermentasi laktosa oleh bakteri golongan coliform. Adapun reaksi fermentasi laktosa oleh mikroorganisme yaitu :
C12H22O11 4CH2CHOHCOOH + H2O
Laktosa enzim asam laktat air
Pada tabel 1, dapat dilihat jumlah tabung positif pada pengenceran 10 ml adalah 3, pengenceran 1 ml adalah 3 dan pengenceran 0,1 ml adalah 2. Jadi diperoleh jumlah positif tabung adalah 3 3 2, sehingga nilai MPN adanlah 11,00 (Lihat pada tabel MPN di landasan teori)
Pada tes pendahuluan ini diduga es batu yang kami gunakan sebagai sampel positif mengandung bakteri coliform. Oleh karena pengenceran yang kami lakukan sebesar 10 ml maka MPN mikroba per 10 ml adalah sebagai berikut.
MPN mikroba = nilai MPN x 1/(pengenceran tabung yang di tengah)
= 11 x 1/10
= 11x 10-1
= 1,1 MPN/10ml
Berdasarkan persyaratan kualitas air secara mikrobiologi, air yang mengandung kurang dari 1 coliform per 100 ml merupakan golongan kelas I yang berarti air tersebut sangat baik untuk dikonsumsi. Nilai coliform 1-2 per 100 ml digolongkan pada kelas II yang berarti air tersebut baik dikonsumsi. Air dengan jumlah coliform 3-10 merupakan golongan air yang termasuk kelas III dan tidak baik dikonsumsi. Sedangkan jika nilai coliform lebih dari 10 per 100 ml, maka air tersebut sudah tidak boleh dikonsumsi lagi. Dari perhitungan di atas berarti es batu yang diuji termasuk ke dalam kategori tidak boleh dikonsumsi karena terdapat 1,1 MPN/10ml.

Uji Penetapan
Berdasarkan hasil pengamatan diatas EMBA (Eosin Methylen Blue Agar) yang terisi bakteri, setelah dilakukan inkubasi selama 24 jam, terdapat koloni bakteri, yang ditunjukkan oleh koloni yang berwarna merah kehijauan mengkilat (hijau metalik). Hal ini karena medium Endo Agar (EMBA) mengandung zat pewarna eosin dan metilen blue, mampu mengembangbiakan koloni bakteri tertentu yang mana kedua zat warna ini akan terakumulasi pada koloninya dalam suasana asam dan akan memberikan warna kehijauan mengkilat yang khas sebagai hasil positif adanya bakteri coliform. Sebaliknya diperoleh hasil negatif yaitu tidak tumbuhnya koloni bakteri jika disebabkan karena campuran zat warna EMBA mampu menghambat pertumbuhan bakteri dan warna yang ditunjukkan koloni bakteri tersebut akan sama dengan warna EMBA.




Uji Pelengkap

Setelah melakukan uji ketetapan, pengujian selanjutnya dengan uji pelengkap yang bertujuan untuk menentukan bentuk dan tipe koloni bakteri dengan melakukan pewarnaan bakteri (pewarnaan Gram).
Pada pewarnaan gram yang telah kelompok kami lakukan diperoleh hasil yang ditunjukkan pada tabel 4. Pada tabel tersebut dapat dilihat bahwa bakteri yang terdeteksi ada pada es batu yang digunakan sebagai sampel berupa bakteri gram negatif. Hal ini ditunjukkan dengan melihat karakteristik bakteri yang teramati yakni berbentuk batang pendek dan berwarna merah setelah dilakukan pewarnaan gram.
Berdasarkan karakteristik yang ditunjukkan tersebut, kelompok kami menduga bakteri coliform tersebut adalah Escherichia coli.

Simpulan
Dari pembahasan di atas maka dapat disimpulkan bahwa sampel yang kami gunakan yakni es batu yang kami beli di sebuah warung positif mengandung bakteri coliform yakni jenis bakteri gram negatif yaitu Escherichia coli. Dari hasil penghitungan MPN mikroba maka es batu tersebut tidak layak untuk diminum.

Daftar Pustaka
Anonim. 2012. Infeksi E.Coli. http://pharos.co.id/ (Diakses tanggal 7 maret 2012)
Fardiaz, Srikandi.1989. Analisis Mikrobiologi Pangan.PT RajaGrafindo Persada. Jakarta
Haffandi, Linda. 2011. Uji Kualitas Air Berdasar Nilai MPN.http://linda-haffandi.blogspot.com/2011/11/uji-kualitas-air-berdasar-nilai-mpn.html (Diakses tanggal 10 maret 2012)
Partic,Li.2008.Media Pertumbuhan Mikroorganisme. http://dunia-mikro.blogspot.com/ (Diakses tanggal 7 maret 2012)
Regobiz,Budi. 2012. Bakteri Gram dan Pewarnaannya. http://rudyregobiz.wordpress.com/ (Diakses tanggal 7 maret 2012)
Suriaman, Edi, dkk. 2008. Uji Kualitas Air. http://www.scribd.com/doc/ (Diakses tanggal 7 maret 2012)
Sudiarti , Trini , dkk. 2005. Analisis Mikrobiologi Escherichia coli o157:h7 pada Hasil Olahan Hewan Sapi dalam Proses Produksinya. Dalam jurnal Makara, Kesehatan, vol. 9, no. 1, Juni 2005: 23-28 (Diakses tanggal 7 maret 2012)