Mikroskop adalah instrument yang paling banyak digunakan dan paling bermanfaat di laboratorium mikroskopi. Dengan mikroskop diperoleh perbesaran sehingga memungkinkan untuk mengamati organism dan struktur yang tidak tampak dengan mata telanjang. Mikroskop memungkinkan perbesaran dalam kisaran luas sampai ratusan ribu kali. Kategori mikroskop adalah mikroskop cahaya atau optis dan mikroskop electron. Mikroskop cahaya yang kesemuanya menggunakan lensa optis mencakup medan terang, medan gelap, fluoresensi dan fase kontras. Mikroskop electron menggunakan berkas electron sebagai pengganti gelombang cahaya untuk memperoleh bayangan yang diperbesar.
1. Mikroskop medan terang
Mikroskop medan terang digunakan untuk memperbesar gambar objek yang diuji, untuk menentukan ukuran, susunan karakteristik dan motilitas bakteri. Dalam mikroskop medan terang, medan mikroskop yang diamati diterangi dengan benderang sehingga objek yang sedang diamati tampak lebih gelap dari pada latar belakangnya. Perbedaran terbatas oleh daya pisah suatu mikroskop yaitu kemampuannya untuk menghasilkan bayangan berlainan dari dua objek yang berdekatan. Daya pisah suatu mikroskop cahaya ditentukan oleh panjang gelombang cahaya dan sifat lensa objektif dan lensa kondensor yang dikenal dengan aperture numeric. Lensa objektif memperbesar gambaran objek biasanya 4-100 kali dan lensa okuler umumnya memperbesar gambaran semu antara 10-15 kali. Jadi yang memberikan perbesaran permulaan adalah system lensa objektif kemudian diperbesar lagi oleh system lensa okuler.
2. Mikroskop medan gelap
Objek yang diamati dalam mikroskop ini terang benderang dan sangat nyata terhadap medan gelap. Mikroskop ini sering digunakan untuk melihat spirochaeta seperti Treponema. Dengan menahan sebagian berkas cahaya yang masuk kedalam kondensor, cincin medan gelap hanya melewatkan berkas cahaya yang mengenai objek pada slide specimen agar memasuki objektif. Karena itu objeknya (mikroba) menjadi diterangi dalam medan mikroskopik yang seharusnya gelap.
3. Mikroskop fluoresensi
Mikroskop fluoresensi digunakan untuk mengamati keberadaan mikroba dalam kultur campuran atau jaringan tumbuhan dan hewan dengan pewarnaan khusus dapat menghasilkan bayangan yang berpendar sehingga mudah untuk diamati. Mikroskop ini menggunakan sinar ultra violet yang tidak terlihat. Organism diwarnai dengan zat warna yang sinarnya terlihat berfluoresen jika dikenai oleh sinar ultra violet.
Pewarnaan dibuat spesifik, bila zat warna melekat pada antibody yang hanya mengikat pada satu tipe organism sebagai contoh jika seseorang mempunyai luka dan dikhawatirkan luka tersebut disebabkan oleh Treponema palidum maka cairan dari luka tersebut dapat diperiksa secara mikroskopis dengan tehnik antibody-fluoresen seperti penjelasan diatas.
4. Mikroskop fase kontras
mikroskop ini digunakan untuk menambah kontras antara sel dengan latar belakangnya antara struktur dalam sel dengan sitoplasma. Mikroskop ini digunakan untuk melihat objek dengan indeks refraksi sinar yang berbeda. System lensa objektif mengubah sinar sehingga ada perbedaan dalam fase antara sinar yang terdefraksi dengan sinar yang tidak mengalami defraksi. Jika sinar yang mengalami defraksi dan yang tidak terdefraksi bersama-sama lagi, ada penurunan intensitas sinar sebab adanya perbedaan fase. Dengan tehnik ini dapat ditemukan letak struktur didalam sel yang tidak diwarnai yang tak teramati dengan mikroskop medan terang.
5. Mikroskop electron
Mikroskop ini memberikan perbesaran yang jauh lebih besar daripada mikroskop cahaya. Ini dimungkinkan karena daya pisah yang lebih besar yang diperoleh karena berkas-berkas electron yang digunakan untuk perbesaran yang mempunyai panjang gelombang yang sangat pendek dibandingkan dengan cahaya. Berkas electron yang digunakan dalam berkas mikroskop electron mempunyai panjang gelombang antara 0,005 sampai 0,0003 nm. Panjang gelombang yang teramat pendek ini memungkinkan dicapainya daya pisah beberapa ratus kali lebih besar dari pada yang dapat diperoleh oleh mikroskop cahaya. Untuk mikroskop electron, specimen yang akan diperiksa dipersiapkan sebagai suatu lapisan kering yang teramat tipis pada layar kecil dan dimasukan diantara kondensor magnetic dan objek magnetic. Bayangan yang diperbesar tampak pada layar fluorensen atau terekam pada film fotografik oleh kamera yang terpasang pada instrument tersebut.
Ada dua macam mikroskop electron yaitu Transmission Electron Microscope (TEM) dan Scanning Electron Microscope (SEM). TEM digunakan untuk mempelajari struktur selular dan hubungan dengan lainnya. Didalam TEM electron menembus specimen yang digunakan untuk membentuk gambar objek. Pelapisan logam berat menambah kontras antara bagian-bagian objek yang berbeda oleh refleksi electron. SEM lebih sering digunakan untuk menjelaskan tentang struktur permukaan mikroba. Dalam SEM, electron yang mengenai specimen menyebabkan pembebasan electron sekunder dari specimen. Electron sekunder dan electron refleksi digunakan untuk membentuk objek.
Tehnik preparasi untuk pengamatan dengan mikroskop cahaya
2 tehnik umum yang digunakan untuk mempersiapkan materi atau specimen untuk pemeriksaan mikroskopis, pertama adalah suspense organism dalam suatu cairan, kedua dengan menggunakan lapisan tipis atau olesan specimen yang dikeringkan, difiksasi dan di cat atau di warnai.
Tehnik preparat basah dan tetes gantung
Preparat basah dan tetes gantung memungkinkan organism hidup yang tersuspensi dalama cairan untuk mengetahui mobilitas atau proses-proses pengamatan dalam keadaaan utuh. Preparat basah diperoleh dengan menaruh setetes cairan yang mengandung organism pada kaca objek dan menutup dengan kaca tutup yang tipis. Sedangkan untuk tetes gantung tersedia kaca objek dengan daerah cekung didalam. Preparat basah dan tetes gantung terutama berguna untuk pengamatan aktivitas hidup seperti motilitas dan juga pengamatan morfologi mikroba yang dapat rusak kkarena perlakuan dengan panas atau bahan kimia atau organism itu sulit diwarnai.
Tehnik pewarnaan
Banyak zat digunakan untuk mewarnai mikroba
Tujuan pewarnaan adalah :
• Mempermudah melihat ukuran dan bentuk mikroba
• Mengidentifikasi struktur luar dan dalam sel mikroba
• Mengamati reaksi sel mikroba terhadap warna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat diketahui
Zat warna yang digunakan umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan reaksi bila mengenai tubuh mikroba, karena zat warna tersebut berbentuk ion positif dan negative.
Secara kimia zat warna digolongkan dalam :
Zat warna basa missal metilen biru, safranin. Zat warna ini mudah untuk bereaksi dengan bagian-bagian inti sel
Zat warna asam missal Na-eosinat, eosin, fukshin, fukshin asam. Zat warna ini mempunyai sifat mewarnai latar belakang sel.
Zat warna indiferen missal sudan III, dimetil-amid-azo-benzol
Factor-faktor penentu keberhasilan dalam pewarnaan mikroba antara lain
1. Fiksasi yang dilakukan sebelum zat warna yang digunakan, bertujuan :
Melekatkan sel pada kaca objek
Membunuh mikroba karena sel dalam keadaan mati lebih mudah diwarnai daripada sel dalam keadaan hidup
Mencegah otolisis sel (pecahnya sel karena enzim yang ada didalamnya)
Merubah daya ikat zat warna
Fiksasi dapat dilakukan secara fisik dengan pemanasan sedangkan secara kimia dengan penambahan sabun, formalin, fenol, bouin
2. Peluntur warna : untuk menghilangkan warna sel yang telah diwarnai. Senyawa ini digunakan untuk menghasilkan keadaan yang kontras pada sel mikroba sehingga dengan jelas dapat diamati dengan mikroskop.
Beberapa jenis peluntur warna antara lain :
Peluntur zat warna asam seperti HNO3, HCL, H2SO4 dan campuran tersebut dengan alcohol
Peluntur zat warna basa seperti KOH, NaOH, sabun dan garam-garam basa
Peluntur zat warna lemah seperti alcohol, air, minyak cengkeh, aseton dan gliserin
Garam dari logam berat seperti AgNO3, CuSO4
Garam dari logam ringan seperti NaSO4, MgSO4
3. Substrat : yang berhubungan dengan kandungan utama sel yang terdiri dari karbohidrat, protein, lemak dan asam nukleat. Zat warna asam dan basa dipengaruhi oleh kehadiran senyawa diatas. Berdasarkan kandungan komposisi selnya, sel dibagi menjadi 3 yaitu :
Sel asidofilik: sel yang mengikat zat warna asam
Sel basofilik : sel yang mengikat zat warna basa
Sel sudanofilik : sel yang larut dalam minyak
4. Intensifikasi pewarnaan: pewarnaan mikroba dapat dipercepat dengan penambahan mordan, meningkatkan zat warna dan temperature pewarnaan
5. Zat warna pembanding : diberikan pada akhir pewarnaan dengan tujuan memberikan warna kontras pada sel mikroba yang diwarnai
Untuk mengamati mikroba dengan jelas dan mempelajari anatominya , digunakan bermacam-macam tehnik pewarnaan, antara lain :
Pewarnaan sederhana adalah pewarnaan tunggal dengan satu zat warna basa yang memberikan kontras yang baik antara specimen dan latar belakangnya. Biasanya sel terwarnai secara merata tetapi pada beberapa organism bilamana zat warna itu metilen biru, beberapa granula didalam sel tampak terwarnai lebih gelap disbanding bagian-bagian sel lainnya.
Pewarnaan diferensial adalah pewarnaan specimen dengan dua atau lebih zat warna basa untuk membedakan struktur seluler. Contoh pewarnaan gram, acid fast, giemsa
Pewarnaan fluoresens adalah pewarnaan specimen dengan warna yang berfluoresens
Pewarnaan negative adalah pewarnaan dengan zat warna asam sehingga specimen dapat dibedakan dari latar belakangnya. Contoh pewarnaan kapsula
Tidak ada komentar:
Posting Komentar